Os reagentes para biologia molecular são produtos indispensáveis na realização de cada uma das técnicas de identificação e análises de materiais genéticos e proteínas. Entre suas funções estão a criação de um ambiente propício, a atividade em si (com as enzimas, por exemplo), ou mesmo a verificação do andamento das avaliações.
Continue a leitura para saber qual a importância dos reagentes utilizados nos processos!
Qual a função dos reagentes para biologia molecular?
Os reagentes são aplicados tanto na coleta, extração e purificação do DNA quanto na reação em cadeia polimerase (PCR, na sigla em inglês). Eles também são fundamentais nos processos de eletroforese, clonagem e sequenciamento.
Na sequência, entenda quais as funções de cada um durante os procedimentos laboratoriais.
Água para PCR
A água para PCR é um produto livre de impurezas, essencial para realização de atividades no laboratório, seja em ensaios, diluição, limpeza de materiais e equipamentos, além do controle de qualidade.
Ela é considerada ultra pura e seu ponto-chave é a mínima interferência, para um resultado mais preciso. Ela é aplicada para processos nas indústrias farmacêuticas, médicas, de semicondutores, além de ser fundamental nas técnicas de biologia molecular, como sequenciamento e PCR.
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dNTP
Nos processos de PCR, qPCR e sequenciamento, há a utilização de nucleotídeos para que a DNA-polimerase possa sintetizar novas fitas. Entre eles, estão os desoxirribonucleotídeos trifosfatos, conhecidos pela sigla dNTP.
A composição é de uma base de azoto, uma desoxirribose e três grupos de fosfato. Os tipos de dNTPs são:
- dATP: desoxiAdenosina Trifosfatada (adenina).
- dCTP: desoxiCitidina Trifosfatada (citosina).
- dGTP: desoxiGuanosina Trifosfatada (guanina).
- dTTP: desoxiTimidina Trifosfatada (timina).
Enzima PFU
Para que haja replicação da fita de DNA, é necessária a aplicação de enzimas DNA-polimerases. Com a adição de dNTP numa reação em cadeia (PCR), a divisão ocorre em escala.
Em específico, a PFU é um tipo de enzima que auxilia na eficiência da técnica em biologia molecular. Ela tem capacidade de ser estável termicamente e realiza a catálise no sentido 5’ → 3’, quando há acréscimo de magnésio, além de fazer exonuclease (3’ → 5’), numa espécie de revisão.
Enzima TAQ
Outra enzima DNA-polimerase é a TAQ. Ela possui esse nome pois o cientista Thomas Brock identificou uma bactéria que reside em fontes termais e a nomeou de Thermus aquaticus.
A partir do seu isolamento, criou-se a enzima com mesmo nome, com a sigla TAQ e a característica de ser termoestável. Ela é utilizada para ampliação de DNA em PCR, uma vez que há necessidade de trabalho em alta temperatura.
Enzima Hot-Start
A Hot Start é outra enzima DNA-polimerase que trabalha na obtenção de novas fitas de material genético e que desempenha seu trabalho apenas quando há aumento de temperatura. Desta maneira, ela evita ampliações não específicas e indesejáveis quando a solução está mais fria.
Uma diferença para a TAQ é que ela melhora a qualidade de precipitação do cloreto de magnésio (MgCl2) na solução.
Enzima T4 Ligase
Já a enzima T4 Ligase trabalha na ampliação de DNA em PCR. Para que haja compatibilidade, é preciso que as duas fitas sejam complementares, assim a enzima junta qualquer final, incluindo as extremidades cegas.
Mas, para que a reação ocorra, elas devem ser perfeitamente complementares. Além disso, é preciso que tenha um fosfato 5´ justaposto e hidroxila 3´ terminal. Caso não esteja presente, a ligação não ocorre.
cDNA
O DNA complementar, conhecido pela sigla cDNA (em inglês), é um material genético sintetizado a partir de um RNA mensageiro (mRNA). Para que a reação ocorra, uma série de reagentes são cruciais, como a enzimas transcriptase reversa e a DNA-polimerase.
Outros produtos necessários são: dNTP, oligonucleotídeo, tampão, cloreto de magnésio, ditiotreitol, além das RNAses OUT e H. O cDNA é útil para criação de bibliotecas, com objetivo de clonar um organismo em outro a qualquer momento, principalmente proteínas.
Marcador de peso molecular: DNA e proteínas
O marcador de peso molecular (ou ladder) é utilizado na eletroforese. Após a realização de um PCR, por exemplo, você pode identificar a dimensão do DNA amplificado.
À medida em que a amostra é exposta à carga elétrica, ela se move na placa a depender da massa molecular. O marcador é inserido em um dos poços e utilizado como referência na visualização do resultado, pois conta com fragmentos de DNA de tamanho conhecido.
Corante de DNA não mutagênico
Para que uma amostra de PCR possa ser visualizada durante a eletroforese, é necessária a adição de um corante. Ele impregna na molécula e, então, adquire a capacidade de emissão de fluorescência. A observação pode ser feita na cuba com uma luz ultravioleta. Um dos produtos mais utilizados é o brometo de etídio.
Agarose
Um dos reagentes para biologia molecular essenciais para realização da eletroforese é o “gel” em que as amostras são colocadas para visualização das bandas e verificação do peso molecular.
Entre os materiais está a agarose. O gel forma uma malha para a passagem das moléculas e, consequentemente, sua separação, seja em ácidos nucleicos ou proteínas.
Tampão de lise
O tampão de lise é uma substância utilizada para manutenção do pH e para evitar a destruição de membranas plasmáticas durante a realização das técnicas de PCR, eletroforese, clonagem e sequenciamentos.
Além desses reagentes para biologia molecular citados, há uma infinidade de outros produtos que se fazem necessários durante a realização de cada técnica. Além de ajudar a manter a solução nas condições adequadas de trabalho, facilitam a identificação e são parte dos processos.
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